ELISA方法【fǎ】现在已经【jīng】被广泛的应【yīng】用【yòng】于各种抗【kàng】原和抗体测定。抛开试剂盒本身【shēn】质量外【wài】，我们在【zài】实验中也有很【hěn】多【duō】因素都会【huì】影响试验的正常【cháng】结【jié】果【guǒ】。其中最常出现的问题是显色【sè】淡，灵敏【mǐn】度偏低【dī】、重【chóng】复性不佳、假【jiǎ】阳性结果和假【jiǎ】阴性结果，不【bú】管出现什么样的结【jié】果都会直接影【yǐng】响我们的实验结果。下面来分析ELISA实【shí】验非【fēi】正常检【jiǎn】测结果产生的常见【jiàn】原因，并分【fèn】析其解决办法，以提高检测质量。

1、方法学的影响

ELISA 测定模【mó】式【shì】包括以下【xià】几种: 双抗体夹【jiá】心法、间接法、双【shuāng】抗原夹心法、IgM 抗体捕捉法、竞争【zhēng】抑制法【fǎ】, 其中竞争【zhēng】抑制法因受操【cāo】作时差所引【yǐn】起的竞争等因素的【de】影响, 结果重复【fù】性较差, 质量较【jiào】难【nán】控制【zhì】。

2、试剂因素

试剂的选择　检测的原理均基于抗原【yuán】抗体反应【yīng】。由【yóu】于该反应过程受多种因【yīn】素【sù】的影响【xiǎng】, 如普【pǔ】遍存在基质效应、交【jiāo】叉反应等, 因而检【jiǎn】测结果【guǒ】难以溯源, 不同【tóng】方【fāng】法、不同试剂之间甚【shèn】至同一试【shì】剂不同批号间【jiān】结果均缺乏可比性。试剂质量在很大程【chéng】度【dù】上决定了检测的水【shuǐ】平, 因此在引入新项目之前必【bì】须对【duì】试剂进行严【yán】格的评估。试剂的【de】评估有以【yǐ】下几个步【bù】骤【zhòu】: (1) 确定开展【zhǎn】该【gāi】项目【mù】的必要性【xìng】; (2) 了解【jiě】该项目现【xiàn】有的检测方法和原理; (3) 在了解试剂的组【zǔ】成【chéng】基【jī】础上选择多【duō】家试剂盒【hé】进行比较【jiào】,判断【duàn】标准【zhǔn】参考方【fāng】法或参考【kǎo】物质, 其次为临床的满【mǎn】意【yì】度及机构的报告如各【gè】级室间质量评价、CDC 报告等; (4) 定期对检【jiǎn】测结果进行追踪反【fǎn】馈直至最终认【rèn】可该试剂。

3、样本因素

标本【běn】干扰因素【sù】包括内源性干扰因素和外源性干扰因【yīn】素,前者【zhě】包括类风湿因子、补体、异嗜性抗体、自身抗体等, 后者包括【kuò】标【biāo】本溶血、标本被污【wū】染、标【biāo】本贮存时间过长、标【biāo】本凝固不全、冷冻【dòng】标本【běn】的反复冻融等。其中【zhōng】外源【yuán】性【xìng】干扰因素是我们在检【jiǎn】测【cè】过程中【zhōng】可以【yǐ】避免【miǎn】也是必须避免的【de】因素, 而【ér】避免【miǎn】内【nèi】源性因【yīn】素【sù】的【de】干【gàn】扰则主要通过选择合适的试剂盒。在临床中遇到少见的疑难【nán】病例【lì】时应当考虑到内源性干扰因素的存在【zài】。以【yǐ】下对外源性干扰【rǎo】因素进行简要说明【míng】:

标本溶血　要【yào】注意【yì】避【bì】免【miǎn】出现严重溶血。血红蛋【dàn】白中含有血【xuè】红素基团, 其具【jù】有【yǒu】类过氧【yǎng】化物的活性, 因此, 在以辣【là】根过【guò】氧化物酶【méi】(ho rseradish peroxidase,HRP) 为标记【jì】酶的【de】ELISA 测定中, 如果血清标本中血红蛋白浓度较【jiào】高, 则其就很容易在温育过程中吸【xī】附于【yú】固相, 从而与后面加【jiā】入的底【dǐ】物反应显色。

ELISA 操作【zuò】步骤复杂, 操作不当将引起较大【dà】的误差。以【yǐ】下叙述各个步【bù】骤中的影【yǐng】响因素【sù】。加样器【qì】是一种比较精密的工具, 其在长时间使用时会因机械【xiè】磨损或者推【tuī】动杆内【nèi】附【fù】着【zhe】血痂等原【yuán】因造成加样不【bú】准【zhǔn】, 尤其是对于样本量较【jiào】大的【de】临床实验室【shì】, 因此必须定期【qī】对加【jiā】液器进行维护和校准。每次加不【bú】同的标本时均【jun1】需更换吸嘴, 以免发生交叉污染。加样时速度【dù】不可太快, 避【bì】免将标本加在孔壁上部, 并注意【yì】不【bú】要溅出或产【chǎn】生气泡。加样时【shí】还应当注意操【cāo】作时【shí】差对结果的影响, 操作时【shí】差是【shì】指加入标本、试剂及混匀时间【jiān】的【de】差异【yì】。操【cāo】作时差在【zài】每【měi】个实验中都存在, 尤其是手工【gōng】操作, 日【rì】常检测【cè】标本多【duō】达几百个【gè】,从【cóng】加【jiā】入第【dì】一个标本【běn】到最后一个标本, 需几十【shí】分钟, 加入试剂【jì】及【jí】混匀等均存在着前后时间差异, 使抗原抗体反应和酶促反应时【shí】间不一致, 操作【zuò】时【shí】差对竞争法【fǎ】检测【cè】的【de】结果影响更大, 在加酶结合物和底【dǐ】物【wù】时可用【yòng】定量多道。