鸭胚胎肝间质细胞永生化

鸭胚胎肝间质细胞永生化
细胞特性
1）来源：上海中科院动物研究所
2）含量：>5x105个/mL
3）污染：支原体、细菌、酵母和真菌检测为阴性
4）规格：T25瓶或者1mL冻存管包装

鸭胚胎肝间质细胞永生化细胞培养步骤
一．培养基及培养冻存条件准备：
1)准备鸭胚胎肝脏【zāng】间充质干细胞【bāo】*培【péi】养基（dmem 高糖和F12培养【yǎng】基1：1搭【dā】配，10%血清 ，1%双抗以及【jí】1％自己配置的间质细胞因【yīn】子。）。
2)培养条【tiáo】件：气相【xiàng】：空气，95%；二氧化碳【tàn】，5%。温度【dù】：37摄氏度【dù】，培养箱湿【shī】度为70%-80%。
3)冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配，液氮储存。

二．细胞处理：
1）复【fù】苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，离心【xīn】管加入4mL培【péi】养基混合均匀。在【zài】1000RPM条件下离心【xīn】9-21分钟【zhōng】，弃去上清液，补加【jiā】1-2mL培养【yǎng】基【jī】后吹匀。然后将所有【yǒu】细胞悬【xuán】液加入T25培【péi】养瓶中培养，补加【jiā】培养基至【zhì】6ml。
2）细【xì】胞传代：如果【guǒ】细胞密【mì】度【dù】达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细【xì】胞9-21次【cì】。
2.加1ml消化液【yè】（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培【péi】养箱【xiāng】中消【xiāo】化9-21分钟，然后在显微【wēi】镜【jìng】下【xià】观察【chá】细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱【tuō】落，迅速拿【ná】回操作台【tái】，轻敲几【jǐ】下培养瓶后加2ml*培养基【jī】终止消化。
3.轻轻打匀后吸出【chū】，在【zài】1000RPM条件下离心【xīn】5分钟，弃去上清液，加【jiā】1-2mL培养液后吹【chuī】匀。
4. 将细胞悬【xuán】液按【àn】1：2到1:5比例分到新【xīn】的含6ml培养基的新【xīn】皿中或【huò】者瓶中。
3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为例；
1．细胞冻【dòng】存【cún】时，弃去培养基后，PBS清洗瓶底【dǐ】9-21次后加入【rù】1ml胰酶，细胞变圆【yuán】脱【tuō】落后，加入2ml*培养基终止消化，可【kě】使【shǐ】用血【xuè】球计【jì】数板计数。
2．1000RPM离【lí】心5分钟去掉上清。用血清【qīng】重悬浮，加DMSO至终浓度为10%。加【jiā】入【rù】DMSO后【hòu】迅速混匀，按【àn】每1ml的数量分【fèn】配到冻存管中，注意冻【dòng】存【cún】管做【zuò】好标识。本公【gōng】司按每个冻存管细胞【bāo】数【shù】目大于1X106个细胞冻存。
3．将冻存管置于程序降温盒中，放入【rù】-80度冰箱，至少2个小时以【yǐ】后转入液【yè】氮灌储存【cún】。记录冻存【cún】管位置【zhì】以便【biàn】下次拿【ná】取【qǔ】。

注意事项： 
1. 收到细胞后，若发现干冰已【yǐ】挥发干【gàn】净、冻存管瓶【píng】盖【gài】脱落、破【pò】损及细【xì】胞有污【wū】染，请立即致【zhì】电我们。
2. 所有动物细胞均【jun1】视为【wéi】有潜在的生物危害【hài】性【xìng】，必须在二级生【shēng】物安全【quán】台内操作【zuò】，并请注【zhù】意防护，所有废液及接触过此细【xì】胞的【de】器【qì】皿需要灭菌【jun1】后方能丢弃。
*次【cì】处理细【xì】胞时，在超净工【gōng】作【zuò】台中打开瓶盖，用浸透75%的酒【jiǔ】精棉【mián】球擦【cā】拭瓶【píng】口外侧，以防止溢出的培养基污染细【xì】胞。

细胞介绍

间充【chōng】质干【gàn】细【xì】胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)是【shì】来源于早期中胚层的一类【lèi】多能干细胞, 在体内具【jù】有【yǒu】分【fèn】布【bù】广泛【fàn】, 体外能够大【dà】量扩【kuò】增和免疫原性低等特点, 是【shì】一种细【xì】胞治疗【liáo】的理想种子细胞。自20世纪60年代，Friedenstein等发现在人骨髓长期培养中, 存在【zài】一种形态【tài】类似【sì】成纤维【wéi】细胞的贴壁生长的细胞且【qiě】移【yí】植到小鼠【shǔ】体内【nèi】具【jù】有成【chéng】骨能力和造血支持作用, 将这种【zhǒng】细胞命名为骨【gǔ】髓【suǐ】基质细【xì】胞(Bone marrow stromal cells, BMSCs)。到20世纪90年代末, 人【rén】们才成功分离【lí】一种具有成骨、成软骨和成脂肪能力的细胞, 称之为【wéi】间充质【zhì】干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)。
随【suí】后研究者也从其他【tā】组织, 如脂肪【fáng】、脐【qí】带、胎盘、肝脏、骨实质和肌肉等中成功分离获得间【jiān】充质干细胞。作为一类成体干细胞中【zhōng】的间充质干细胞, 目【mù】前大部分的研究集中在人及大鼠、小【xiǎo】鼠【shǔ】这两种模式动物上, 其他动物的【de】间充质干细胞报道【dào】相对较少。选取中国*家【jiā】禽品种【zhǒng】鸭子为实验材料, 以鸭胚胎肝脏【zāng】中的间充质【zhì】干细【xì】胞为【wéi】研究对象, 对其进行分离【lí】培养鉴【jiàn】定, 进行【háng】增殖能力检测【cè】及分化能【néng】力鉴定, 为【wéi】家禽干细胞研究及畜【chù】禽遗【yí】传【chuán】资源【yuán】保存提供【gòng】借鉴及参考。鸭胚胎肝【gān】间质细胞进行【háng】慢病毒转【zhuǎn】染8-12h，连续传13代，采【cǎi】用高【gāo】浓度【dù】含嘌【piào】呤霉素【sù】培养基（4μg/mL）培养【yǎng】，筛选阳性克隆【lóng】；筛选出阳性【xìng】永生化鸭胚【pēi】胎肝间质细胞。
 

鸭胚胎肝间质细胞永生化运输和保存：可选择干冰运输及发送【sòng】复苏【sū】存活【huó】细胞方式：（1）干冰运输，收【shōu】到【dào】后立即转入液【yè】氮冻【dòng】存或直接复苏；（2）存活细【xì】胞，收到【dào】后应继续生长，传代【dài】达到细胞生长【zhǎng】状态良好【hǎo】时，再【zài】进行冻存。具【jù】体操作见细胞【bāo】培养步骤【zhòu】。=

细胞用途：仅供使用。