本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断

本试【shì】剂盒【hé】用于体外【wài】定【dìng】量检测血清、血浆、组织【zhī】匀浆及相关液体样【yàng】本中大鼠血管【guǎn】内【nèi】皮生长因子受体1(VEGFR1/Flt-1)的含量。

有效期：6个月

保存条件：9-21℃

试剂盒组成：

备注：

1.（96T/48T）打开包装后请及时检查所有物品是否齐全。

2. 标准品浓度依次为：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 经过【guò】大量正【zhèng】常标本检验，标本的正常浓度值【zhí】均在【zài】试剂盒提供的检测范【fàn】围内，实【shí】验【yàn】过程中直接【jiē】取50μL样【yàng】本上样即可。当【dāng】有部【bù】分样本值超过标准品浓度【dù】时，可用样本稀【xī】释液【yè】将标本进行适当【dāng】稀【xī】释后再进行实验。

检测前准备工作：

1. 请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2. 从冰箱中取【qǔ】出的浓【nóng】缩洗涤液可能有结晶，属于【yú】正常【cháng】现象；放置室温，轻摇【yáo】均匀，待结晶溶【róng】解后再【zài】配置洗涤液。可将【jiāng】20ml浓缩【suō】洗涤液用蒸馏水或【huò】去【qù】离子水稀释配置成【chéng】400ml工作浓度的【de】洗涤液，未用【yòng】完的放回4℃

3. 20×洗涤【dí】缓冲液的【de】稀释：蒸馏水按【àn】1：20稀释，即1份20×洗涤缓冲【chōng】液加19份蒸馏水。

实验原理：

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预【yù】先包被【bèi】大鼠血管内皮生长因【yīn】子受体1(VEGFR1/Flt-1)捕获抗体【tǐ】的【de】包【bāo】被微【wēi】孔【kǒng】中【zhōng】，依【yī】次加入标本、标【biāo】准品、HRP标【biāo】记【jì】的检测抗体，经过【guò】温育洗涤。用底【dǐ】物TMB显色，TMB在【zài】过氧化【huà】物酶【méi】的催【cuī】化下转化成蓝【lán】色，并【bìng】在酸的作用下转化【huà】成黄色。颜【yán】色的深浅和样品中的【de】大鼠血管内皮生长因子受体1(VEGFR1/Flt-1)呈【chéng】正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定【dìng】吸光度（OD 值），计算【suàn】样品浓度。

实验所需自备试验器材：

1. 酶标仪（450nm）

2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒温箱

4. 蒸馏水或去离子水

样本处理及要求：

1. 血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20 分钟，取【qǔ】上【shàng】清即【jí】可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避【bì】免反【fǎn】复冻融【róng】。

2. 血浆：用EDTA或肝素【sù】作为【wéi】抗凝【níng】剂采集标【biāo】本，并将标本在采集后的30分钟内于9-21℃ 1000×g离心15分【fèn】钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保【bǎo】存，但应避【bì】免反复冻【dòng】融【róng】。

3. 组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组【zǔ】织，去除残【cán】留血液（匀浆中裂解的红细【xì】胞会影响测量结果），称重后将组织【zhī】剪【jiǎn】碎。将剪【jiǎn】碎的组【zǔ】织【zhī】与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体【tǐ】积比，比如1g的组织样品对【duì】应9mL的PBS，具体体积可根据【jù】实【shí】验需要适当调【diào】整，并做【zuò】好记录。推荐在PBS中【zhōng】加入蛋【dàn】白酶抑【yì】制剂）加入【rù】玻璃匀浆【jiāng】器中，于冰【bīng】上充分【fèn】研磨。为了进一步裂解组织细胞，可【kě】以【yǐ】对匀浆液进行超【chāo】声破碎，或反复【fù】冻融。将匀【yún】浆【jiāng】液于5000×g离心5~10分钟，取上清检【jiǎn】测。

4. 细胞培养物上清：请1000×g离心20分【fèn】钟，取上【shàng】清即【jí】可检测，或将【jiāng】上清置于-20℃或-80℃保【bǎo】存，但应避免反复【fù】冻融。

5. 其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

6. 样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7. 样品保存：样品收集后若在1周内进行检测的可保存于4℃，若不能及时检测，请按一次使用【yòng】量分装，冻【dòng】存于-20℃（1个月内检测），或-80℃（6个月内检测【cè】），避免反复冻【dòng】融【róng】，标本溶【róng】血会影响检测结【jié】果，因此【cǐ】溶血标本【běn】不【bú】宜进行【háng】此项检测。

注意事项：

1. 严格按照规【guī】定的时【shí】间【jiān】和温【wēn】度进行温育【yù】以保证准确结果【guǒ】。所有试剂都必须【xū】在【zài】使用前达到室温9-21℃。使用后立即冷藏保存试剂。

2. 洗板不正确可以导致不【bú】准确的结果。在加入【rù】底【dǐ】物前确保尽量吸干孔内液体【tǐ】。温育过【guò】程【chéng】中不【bú】要让【ràng】微孔干燥【zào】掉。

3. 消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。

5. 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6. 在储存和温育时避免强光直接照射。

7. 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8. 任何反【fǎn】应【yīng】试【shì】剂不能接触漂白【bái】溶剂或漂白溶【róng】剂所【suǒ】散发的强烈气体。任【rèn】何【hé】漂【piāo】白成分都会破坏试剂盒中反应试【shì】剂的生物活性。

9. 不能使用过期产品。

10. 如【rú】果可能传播【bō】疾病，所【suǒ】有的样品都【dōu】应【yīng】管理好，按照规定的【de】程序处理样品和检测【cè】装置。

操作步骤：

1．从室温平【píng】衡60min后的铝【lǚ】箔袋【dài】中取【qǔ】出所需板条，剩余板【bǎn】条用自封袋【dài】密【mì】封放回4℃。

2．设置标准品孔和【hé】样本孔，标准品孔各【gè】加不同浓度的标准【zhǔn】品50μL。

3．样本孔中a加入待测样本50μL；空白孔不加。

4．除空白孔外【wài】，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根【gēn】过【guò】氧【yǎng】化物酶（HRP）标【biāo】记的检测抗体100μL，用封板膜封住【zhù】反应【yīng】孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5．弃去【qù】液体，吸水【shuǐ】纸【zhǐ】上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸【zhǐ】上【shàng】拍干【gàn】，如此重复洗板【bǎn】5次（也可用洗板机洗板）。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每孔加入【rù】终【zhōng】止液【yè】50μL，15min内【nèi】，在【zài】450nm波长处测定各孔【kǒng】的OD值。

实验结果计算：

绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准【zhǔn】品【pǐn】浓度作横坐标，对应OD值作纵坐【zuò】标，绘制出标准品线性回归曲【qǔ】线，按曲线方程计算各【gè】样【yàng】本浓度【dù】值【zhí】。

（此图仅供参考）

性能：
1. 检测范围：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2. 灵敏度：检测浓度小于1.0 pg/mL。

3. 特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4. 重复性：板内变异系数小于10% ，板间变异系数小于15% 。

技术小提示：

1. 当混合或重溶蛋白溶液时，尽量避免起沫。

2. 为了避免交叉感【gǎn】染【rǎn】，配置不同浓度标准品【pǐn】、上样、加不同试剂都【dōu】需要更换【huàn】枪头。另【lìng】外不同试剂请分【fèn】别使用【yòng】不同的移液【yè】槽。

3. 每次孵育时，请正确使用封板胶可保证结果的准确性。

4. 混【hún】合后的显色底物【wù】在【zài】上板前应为无【wú】色，请避光保存；假如微孔【kǒng】板后，将【jiāng】由物色变成不【bú】同深度的蓝【lán】色。

5. 终止液上板顺序应同显【xiǎn】色底【dǐ】物【wù】上【shàng】板顺序一致；加入终止液后，孔内颜色由蓝变黄；若孔【kǒng】内【nèi】有绿【lǜ】色，则表明【míng】孔【kǒng】内液体未混匀；请充分混合。

说明：

1. 由于【yú】现【xiàn】有条件及科学技术水【shuǐ】平尚不能对【duì】所有供货商提供的所【suǒ】有原【yuán】料进行全面的鉴【jiàn】定与分析，本产品【pǐn】可能存在一【yī】定的质量【liàng】技术风【fēng】险。

2. 实验结果与试剂的【de】有效性、实验者【zhě】的【de】相关【guān】操作以及当时的实验环境密切相关，请【qǐng】务必【bì】准备充足【zú】的【de】标本备份。

3. 不【bú】同批次的同一产【chǎn】品【pǐn】可【kě】能会有【yǒu】少许差【chà】别【bié】，如：检测限、灵【líng】敏度以及显色时间等，请依据试剂盒内说明书进行实验【yàn】操作，网站电【diàn】子版说明【míng】书【shū】仅作参考。

4. 只【zhī】有全部使用本试剂盒配套【tào】试【shì】剂才【cái】能保证检测效果，不能【néng】混用【yòng】其他制造商的产品。只【zhī】有【yǒu】严格遵守本试剂盒的【de】实验说明才会得到【dào】检测结果。