本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断

本【běn】试剂【jì】盒用【yòng】于体外定量检测【cè】血清【qīng】、血浆【jiāng】、组织匀浆及相关液体样本中大鼠周【zhōu】期素依赖【lài】性激酶5(CDK5)的含量。

有效期：6个月

保存条件：9-21℃

试剂盒组成：

备注：

1.（96T/48T）打开包装后请及时检查所有物品是否齐全。

2. 标准品浓度依次为：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 经过大量正常标【biāo】本检验，标本的正【zhèng】常浓度值均在试剂盒【hé】提供【gòng】的检测范【fàn】围内，实验【yàn】过程中直接取【qǔ】50μL样本【běn】上样即可。当【dāng】有部分样本值超【chāo】过标准品浓度时，可用【yòng】样本【běn】稀【xī】释液【yè】将标本进行适当稀释【shì】后再进行实【shí】验。

检测前准备工作：

1. 请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2. 从冰箱中取出的浓缩洗【xǐ】涤【dí】液可能有结晶【jīng】，属于正常现象；放置【zhì】室温，轻【qīng】摇均匀，待结晶溶解后【hòu】再配【pèi】置洗涤液。可将【jiāng】20ml浓缩洗涤液用蒸馏水【shuǐ】或去【qù】离子水稀释配置成【chéng】400ml工作浓【nóng】度的洗【xǐ】涤液，未用完【wán】的放回4℃

3. 20×洗涤缓【huǎn】冲液【yè】的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即【jí】1份20×洗涤【dí】缓冲液加19份蒸馏【liú】水。

实验原理：

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包【bāo】被大鼠周【zhōu】期【qī】素【sù】依赖性【xìng】激酶5(CDK5)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品【pǐn】、HRP标记的检【jiǎn】测抗体【tǐ】，经过温育洗【xǐ】涤。用【yòng】底物TMB显【xiǎn】色，TMB在过氧化物酶【méi】的【de】催化下【xià】转化成蓝色，并【bìng】在酸的作【zuò】用下转化成黄色【sè】。颜色的深浅和样品中的大鼠周期素依赖【lài】性【xìng】激酶5(CDK5)呈【chéng】正相【xiàng】关。用酶标仪在450nm 波长【zhǎng】下测【cè】定吸【xī】光度【dù】（OD 值），计算样品浓【nóng】度。

实验所需自备试验器材：

1. 酶标仪（450nm）

2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒温箱

4. 蒸馏水或去离子水

样本处理及要求：

1. 血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后【hòu】1000×g离心20 分【fèn】钟，取上【shàng】清即【jí】可，或将上清置【zhì】于-20℃或-80℃保存，但应避免反复【fù】冻融。

2. 血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标【biāo】本在采【cǎi】集后的30分钟内【nèi】于【yú】9-21℃ 1000×g离心【xīn】15分钟，取【qǔ】上清即【jí】可检测【cè】，或将上【shàng】清置于-20℃或-80℃保存，但应避【bì】免反复冻融。

3. 组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除【chú】残留【liú】血【xuè】液【yè】（匀浆中裂解的【de】红细胞会影响测【cè】量结【jié】果【guǒ】），称重【chóng】后将组织【zhī】剪碎。将剪碎的【de】组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验【yàn】需要【yào】适当调整，并做好【hǎo】记录。推荐在PBS中加【jiā】入蛋【dàn】白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于【yú】冰上充分【fèn】研【yán】磨。为了进一步裂解组织细胞，可以【yǐ】对匀浆液进行【háng】超声破【pò】碎，或反复【fù】冻融。将匀浆液【yè】于【yú】5000×g离心5~10分钟【zhōng】，取上清检测。

4. 细胞培养物上清：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测【cè】，或将【jiāng】上清置于-20℃或-80℃保存，但应【yīng】避免反复冻【dòng】融。

5. 其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

6. 样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7. 样品保存：样品收集后若在1周内进行【háng】检测的可保【bǎo】存于【yú】4℃，若不能【néng】及时检测，请按一次使【shǐ】用【yòng】量分装，冻存于-20℃（1个月【yuè】内检【jiǎn】测【cè】），或-80℃（6个【gè】月内检测），避免反复【fù】冻融，标本溶血会影【yǐng】响检测结果，因此溶【róng】血标本不宜进行此项检【jiǎn】测。

注意事项：

1. 严格按照规定的时间和温度【dù】进行【háng】温育以【yǐ】保证准确结果。所有试剂都必须在使用【yòng】前【qián】达【dá】到室【shì】温【wēn】9-21℃。使用后立即冷藏保存试剂。

2. 洗板不正确可以导【dǎo】致不准确的【de】结果【guǒ】。在加入底【dǐ】物前确保尽量【liàng】吸干【gàn】孔内液体。温育过程【chéng】中不要让微孔干燥掉。

3. 消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。

5. 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6. 在储存和温育时避免强光直接照射。

7. 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8. 任何反应试剂【jì】不能接触漂白【bái】溶剂或漂白溶剂【jì】所【suǒ】散发的强烈【liè】气体。任何漂白成分都【dōu】会破【pò】坏试【shì】剂【jì】盒【hé】中反应试剂的生物活性。

9. 不能使用过期产品。

10. 如果可能传播疾病，所有【yǒu】的【de】样【yàng】品都应【yīng】管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。

操作步骤：

1．从【cóng】室温【wēn】平衡60min后【hòu】的铝箔袋中取出所需板条，剩余【yú】板条用自封【fēng】袋【dài】密封放回4℃。

2．设置【zhì】标准品孔和样本孔，标准品孔各加不【bú】同【tóng】浓【nóng】度【dù】的标准品50μL。

3．样本孔中a加入待测样本50μL；空白孔不加。

4．除空【kōng】白孔外，标准品【pǐn】孔和样本孔中每孔加入辣根过【guò】氧化物酶（HRP）标【biāo】记的检测抗体100μL，用封【fēng】板膜封住【zhù】反【fǎn】应孔，37℃水浴锅或恒【héng】温箱温育60min。

5．弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤【dí】液【yè】（350μL），静【jìng】置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次【cì】（也【yě】可用洗板【bǎn】机【jī】洗【xǐ】板）。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波【bō】长【zhǎng】处测定【dìng】各孔的OD值。

实验结果计算：

绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度【dù】作横【héng】坐标，对应【yīng】OD值作纵坐标【biāo】，绘制【zhì】出标准品线性【xìng】回归曲线，按【àn】曲线方程计算【suàn】各样本浓度【dù】值。

（此图仅供参考）

性能：
1. 检测范围：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2. 灵敏度：检测浓度小于1.0 pg/mL。

3. 特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4. 重复性：板内变异系数小于10% ，板间变异系数小于15% 。

技术小提示：

1. 当混合或重溶蛋白溶液时，尽量避免起沫。

2. 为了避免交叉【chā】感染，配置不同浓度标准【zhǔn】品、上样、加不【bú】同试剂都需要更【gèng】换枪头。另外不【bú】同【tóng】试剂请分别使【shǐ】用不同的移液槽。

3. 每次孵育时，请正确使用封板胶可保证结果的准确性。

4. 混合后的显【xiǎn】色底物在上板前应为无色，请避【bì】光保【bǎo】存；假如微孔板后，将由物色【sè】变成不同深【shēn】度的蓝【lán】色【sè】。

5. 终止【zhǐ】液上板顺序应同【tóng】显色【sè】底物上板顺序一致；加【jiā】入【rù】终止液后，孔内颜色由【yóu】蓝变黄；若孔内有绿【lǜ】色，则表【biǎo】明孔内液体未【wèi】混匀；请充【chōng】分混合。

说明：

1. 由于现有条【tiáo】件及科学【xué】技术水平尚不能对所【suǒ】有【yǒu】供货【huò】商提供的所有原料进行【háng】全面的鉴定与分析，本产品可【kě】能存【cún】在一定【dìng】的质【zhì】量技术风险。

2. 实验结果【guǒ】与试剂【jì】的有效性、实验【yàn】者的【de】相关操作以及当时的【de】实验环境密切相关，请【qǐng】务必准备【bèi】充足【zú】的标本备份【fèn】。

3. 不同【tóng】批次的同一产品【pǐn】可能会有少许差别，如：检【jiǎn】测【cè】限、灵敏度【dù】以及显色【sè】时间【jiān】等，请依据试剂盒内说明书进【jìn】行实验操作【zuò】，网站电子【zǐ】版【bǎn】说明书仅作参考。

4. 只有全部使用本试剂盒配套试剂才能保证检测【cè】效果，不【bú】能混用其他制造商【shāng】的产品。只有【yǒu】严格遵【zūn】守本试【shì】剂盒的实验说明【míng】才会得到【dào】检【jiǎn】测结果。