本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断

本试剂盒【hé】用于体外定【dìng】量检测血清【qīng】、血浆、组织匀浆【jiāng】及相关【guān】液体样【yàng】本中大鼠诱导型【xíng】NO合酶(iNOS)的含量。

有效期：6个月

保存条件：9-21℃

试剂盒组成：

备注：

1.（96T/48T）打开包装后请及时检查所有物品是否齐全。

2. 标准品浓度依次为：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 经过大量正常标本【běn】检验，标本【běn】的正【zhèng】常浓度值【zhí】均在试剂盒提供的检测范围内【nèi】，实验过【guò】程中直【zhí】接取50μL样本上样即可【kě】。当有【yǒu】部分样本值超过标准品浓度时，可用【yòng】样本【běn】稀释液将标本进行【háng】适当稀释【shì】后再【zài】进行实验。

检测前准备工作：

1. 请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2. 从冰箱【xiāng】中取【qǔ】出的浓缩洗涤液【yè】可能有结晶，属于【yú】正常现象；放置【zhì】室【shì】温，轻摇均匀，待结晶溶解后再配置洗【xǐ】涤液。可将20ml浓缩洗涤【dí】液用蒸馏水或去离子水【shuǐ】稀释配置成【chéng】400ml工作浓【nóng】度【dù】的洗涤液，未【wèi】用完的放回4℃

3. 20×洗【xǐ】涤【dí】缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份20×洗涤缓冲【chōng】液加19份蒸馏【liú】水。

实验原理：

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往【wǎng】预先包被大鼠诱导型NO合酶(iNOS)捕获抗体的包被微【wēi】孔中，依次加入标本【běn】、标准品、HRP标记的【de】检【jiǎn】测抗体【tǐ】，经【jīng】过温育洗涤。用底物【wù】TMB显色，TMB在过氧化物酶【méi】的催化下转化成蓝色，并在【zài】酸的作用下【xià】转化成黄色。颜色【sè】的深浅和样品【pǐn】中的大鼠诱导【dǎo】型NO合【hé】酶【méi】(iNOS)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值【zhí】），计【jì】算样品【pǐn】浓度。

实验所需自备试验器材：

1. 酶标仪（450nm）

2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒温箱

4. 蒸馏水或去离子水

样本处理及要求：

1. 血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20 分钟，取【qǔ】上清【qīng】即可，或【huò】将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复【fù】冻【dòng】融。

2. 血浆：用EDTA或肝素作为抗凝【níng】剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟【zhōng】内于9-21℃ 1000×g离心【xīn】15分钟，取【qǔ】上清即可【kě】检【jiǎn】测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避【bì】免【miǎn】反复冻融。

3. 组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆【jiāng】中裂解【jiě】的【de】红【hóng】细胞会【huì】影响【xiǎng】测【cè】量结果【guǒ】），称重后将组织剪碎【suì】。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般【bān】按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积【jī】可根据实【shí】验需要适【shì】当【dāng】调整，并做好记录【lù】。推荐在【zài】PBS中【zhōng】加入蛋白【bái】酶抑制剂）加入玻璃【lí】匀浆器中，于【yú】冰上充分研磨。为了进一步裂【liè】解组织细胞【bāo】，可【kě】以对匀浆【jiāng】液进【jìn】行超声破碎，或反复冻【dòng】融。将匀浆液于5000×g离心5~10分【fèn】钟【zhōng】，取上清检测。

4. 细胞培养物上清：请1000×g离心【xīn】20分钟，取上清即可检测，或将上【shàng】清置于-20℃或【huò】-80℃保存，但应避【bì】免反【fǎn】复【fù】冻【dòng】融。

5. 其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

6. 样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7. 样品保存：样品收集后若在1周内进【jìn】行检【jiǎn】测的可【kě】保存于【yú】4℃，若【ruò】不能【néng】及时检测，请按一【yī】次使用量分装，冻存于【yú】-20℃（1个月内检【jiǎn】测），或-80℃（6个月内【nèi】检测），避免反复冻融，标本溶血会影响检测结果，因【yīn】此溶血标本不【bú】宜进行此项检测【cè】。

注意事项：

1. 严格按【àn】照【zhào】规定的【de】时间和温度进行温【wēn】育【yù】以保证准确结【jié】果。所有试【shì】剂都必【bì】须在使用前达到室温9-21℃。使用后立即冷藏保存试剂。

2. 洗板不正确可【kě】以导致【zhì】不【bú】准确的结果。在加入底【dǐ】物前确保【bǎo】尽量吸【xī】干孔内液体。温育过程中不要让微【wēi】孔干燥【zào】掉。

3. 消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。

5. 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6. 在储存和温育时避免强光直接照射。

7. 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8. 任何反应试剂【jì】不【bú】能接触漂白溶剂或漂【piāo】白【bái】溶剂所散【sàn】发的强烈气体【tǐ】。任【rèn】何漂白【bái】成分都会破坏试剂盒中反应试剂的生物【wù】活性。

9. 不能使用过期产品。

10. 如果可能传【chuán】播疾病，所有的样品都【dōu】应管理【lǐ】好，按照规定【dìng】的程序【xù】处理样品和【hé】检【jiǎn】测装置。

操作步骤：

1．从室温平衡60min后的铝箔【bó】袋中取出所需板条，剩余板【bǎn】条用自封袋密封放【fàng】回4℃。

2．设【shè】置标准品【pǐn】孔和【hé】样本孔，标准品孔各加不同浓【nóng】度的标准【zhǔn】品50μL。

3．样本孔中a加入待测样本50μL；空白孔不加。

4．除空白孔外，标准品孔和样【yàng】本孔中每孔加入辣根【gēn】过【guò】氧化物【wù】酶【méi】（HRP）标记的检测抗体【tǐ】100μL，用封【fēng】板膜封【fēng】住反应孔，37℃水浴锅【guō】或恒温【wēn】箱温育60min。

5．弃去液体，吸水纸上【shàng】拍干【gàn】，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去【qù】洗涤【dí】液，吸水纸上拍干，如此重复【fù】洗板5次（也可用【yòng】洗板【bǎn】机洗板）。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每【měi】孔加【jiā】入【rù】终止液【yè】50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

实验结果计算：

绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横【héng】坐标，对【duì】应OD值作纵坐【zuò】标，绘【huì】制出标准品线性回归曲线，按曲线方【fāng】程计算各样本【běn】浓度【dù】值。

（此图仅供参考）

性能：
1. 检测范围：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2. 灵敏度：检测浓度小于1.0 pg/mL。

3. 特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4. 重复性：板内变异系数小于10% ，板间变异系数小于15% 。

技术小提示：

1. 当混合或重溶蛋白溶液时，尽量避免起沫。

2. 为了避免交叉【chā】感染，配置不同浓度标准【zhǔn】品、上样、加不同试剂都需要【yào】更【gèng】换枪头。另【lìng】外【wài】不同【tóng】试剂请分别【bié】使用不同的移液槽。

3. 每次孵育时，请正确使用封板胶可保证结果的准确性。

4. 混合后的【de】显色底物在上【shàng】板前应为无色【sè】，请避光保存；假如微孔板后【hòu】，将由物色变成【chéng】不【bú】同深度【dù】的蓝色。

5. 终【zhōng】止液上板【bǎn】顺序应同显【xiǎn】色【sè】底物【wù】上板顺序一致；加入【rù】终止液后，孔内颜【yán】色由蓝变黄；若孔【kǒng】内有绿色，则【zé】表明孔内液体未【wèi】混匀；请充分混合。

说明：

1. 由于现有【yǒu】条件及科学技术水平尚不能对所【suǒ】有供货商提供的所有原【yuán】料进行全【quán】面的鉴定与【yǔ】分【fèn】析，本【běn】产【chǎn】品可能存在一定【dìng】的质量技术风险。

2. 实验结果与试剂的有效【xiào】性、实验者的相关操作【zuò】以及当【dāng】时的【de】实验环【huán】境【jìng】密切相关，请【qǐng】务必准备充足【zú】的标【biāo】本备份。

3. 不同批次的【de】同一产品可能会有少许差别，如：检测限【xiàn】、灵【líng】敏【mǐn】度【dù】以【yǐ】及显色时间【jiān】等，请依【yī】据试剂盒内说明【míng】书进【jìn】行实验【yàn】操作，网站电子版说明书仅作参考。

4. 只有全部使用【yòng】本试剂【jì】盒配套试剂【jì】才能保证检测效果，不能混【hún】用其他制造商【shāng】的产品【pǐn】。只有严格遵守【shǒu】本试剂盒的实验说明才【cái】会得到【dào】检测结【jié】果。