上海酶联生物在我司原代细胞操作中，我们都【dōu】认为实验【yàn】的原理似乎很【hěn】简单，不外乎固【gù】定【dìng】抗【kàng】原，添加一抗、二抗和底【dǐ】物，间中夹杂着洗涤【dí】和封闭。 

　　原代细胞培养实验步骤：

 

　　1、取7-10d雄性SD大鼠，颈椎脱臼处【chù】死【sǐ】,浸泡于75%乙醇消毒3-5min。
 

　　2、在超净工作台【tái】中，将【jiāng】大【dà】鼠断头置【zhì】于玻【bō】璃培养皿中，打开颅腔后取出全脑,放在【zài】盛有预冷的PBS玻璃【lí】培养皿中，去除小脑和间脑。
 

　　3、将大脑半球在干【gàn】滤纸上缓慢滚动以去除软【ruǎn】脑【nǎo】膜和脑膜大血管【guǎn】，再放在【zài】新的【de】盛【shèng】有【yǒu】预冷【lěng】的PBS玻璃培养皿中。
 

　　4、用【yòng】细解剖镊去除【chú】大脑白质【zhì】、残余大血管和软【ruǎn】脑【nǎo】膜，保留大【dà】脑皮质。
 

　　5、大脑皮质放于【yú】DMEM中(含庆-大霉素【sù】和谷-氨酰胺 )，剪碎成约1mm3大【dà】小，放入50ml的离心【xīn】管中，加入【rù】混合【hé】酶液I(0.9-21 .1%II型胶原酶，0 .025-0 .05%IV型胶原酶，200-400U DNaseI)，混【hún】匀后37℃水浴【yù】消【xiāo】化9-21.5h。
 

　　6、室温1 000×g离心【xīn】8min，去上清液【yè】。
 

　　7、沉淀中加入20%BSA重悬浮，充分混【hún】匀【yún】，1 000×g，20min，4℃离心【xīn】，去上清【qīng】。
 

　　8、沉【chén】淀加入4ml混合【hé】酶【méi】液II( 0.9-21.1%的胶原酶/分散酶，0.9-21.1%I型胶【jiāo】原酶，100-300U DNaseI )重悬浮，混匀，37℃水浴消化0.5-1h，700×g室温离【lí】心6min，去上清液【yè】。
 

　　9、沉淀加入2ml DMEM(含【hán】庆-大【dà】霉素和谷-氨【ān】酰胺)培养【yǎng】液悬【xuán】浮混匀【yún】，铺于经【jīng】离心形成连续梯【tī】度的12ml 50%Percoll(25 000×g，60min，4℃)，1000×g，4℃离心10min。
 

　　10、靠近底部的红细【xì】胞层之【zhī】上【shàng】的白的层面即为纯化【huà】的微血管段，吸出后DMEM
 

　　加入DMEM*培养液(20%FBS，4ug/ml嘌呤霉素 )重悬【xuán】浮，接种于含5%的大【dà】鼠 血清37℃孵育过【guò】夜所制备的【de】细胞培养皿中，置于【yú】37℃、5%CO2培【péi】养箱内【nèi】静置培养【yǎng】24h后【hòu】更换不含嘌呤霉素的混【hún】合培养基，随后【hòu】隔天换【huàn】液。
 

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